Métodos para identificar fosforilação e glicosilação de proteínas

Os principais métodos para identificar a fosforilação são os seguintes: a. Análise de fosforilação in vitro: Reações radiométricas de quinase usando 32P-gama-ATP podem ser usadas para detectar o estado de fosforilação in vitro; este método é semiquantitativo, mas pode determinar o peso molecular de proteínas fosforiladas. b. Rotulagem de pulso radioativo: Para detectar a fosforilação in vivo, a marcação de pulso radioativo pode ser usada; as células são cultivadas na presença de 32P-ortofosfato e, em seguida, uma determinada proteína é imunoprecipitada com um anticorpo específico. O radioisótopo obtido por precipitação é analisado por eletroforese SDS-PAGE e quantificado por exposição a filme de raios X. Este método pode detectar a fosforilação sob várias condições fisiológicas. c. Anticorpos específicos para fosforilação: Existem duas categorias de anticorpos específicos para fosforilação. A primeira categoria é um anticorpo universal de fosforilação tirosina/serina/treonina que se ligará a qualquer molécula de tirosina fosforilada, serina fosforilada e treonina fosforilada, independentemente dos resíduos de aminoácidos adjacentes; a segunda categoria de anticorpos é um anticorpo epítopo de aminoácido específico para fosforilação. Claro, os métodos acima podem ser combinados com o modo de aquisição de dados ou após espectrometria de massa para identificar locais de fosforilação (putativos), usar anticorpos universais para locais de fosforilação para determinar se a proteína alvo é fosforilada em um tipo específico de local através de imunoprecipitação (IP) .

A análise de glicosilação pode ser realizada por digestão enzimática (como digestão com tripsina) da proteína a ser analisada, seguida pela análise de glicopeptídeos usando cromatografia líquida-espectrometria de massa (LC-MS) ou cromatografia de interação hidrofílica-espectrometria de massa em tandem (HILIC-MS/ MS) para identificar todas as proteínas com moléculas de glicano específicas ou os locais de ligação de glicano na proteína alvo. Além disso, para alguns glicopéptidos, a análise por espectrometria de massa (MS) de proteínas intactas pode fornecer dados sobre a identificação de espécies proteicas e o seu estado de glicosilação, mas com uma resolução mais baixa.

Em resumo, embora os métodos para identificar a fosforilação e a glicosilação de proteínas sejam diferentes, ambos podem ser analisados ​​utilizando espectrometria de massa, incluindo a identificação de proteínas fosforiladas/glicosiladas, locais de modificação de fosforilação/glicosilação e níveis de modificação. A espectrometria de massa também se tornou uma das tecnologias de pesquisa de modificação pós-tradução mais populares devido à sua resolução, precisão e sensibilidade superiores.